國家衛生研究院/生醫工程與奈米醫學研究所 林淑宜 廖芳瑄
前言
我們發現治療革蘭氏陰性菌感染的抗生素和在細菌死亡後所釋放的生物活性分子：脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)，兩者間有很強的吸引力，干擾‘低’劑量抗生素的殺菌效果，產生疑似抗生素不中用的錯覺，這現象可以解釋為什麼臨床醫師在使用抗生素治療患者時，隔一段時間就必須提高抗生素之使用劑量，以達預期療效；若遇上不照醫囑而自行間斷用藥的患者，長期循環為之，容易衍生出多重抗藥性之超級細菌。相對於革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌容易突變而易產生抗藥性，2019 年世界衛生組織(WHO)認為抗藥性格蘭氏陰性菌對全球公共衛生極具威脅[1]，且抗生素的研發和上市的速度在 2010 年後明顯減緩，追不上細菌抗藥機制變化多端的速度。目前可利斯汀（colistin，一種環狀類胜肽化合物）是此類多重抗藥革蘭氏陰性菌感染防疫的最後一線抗生素[2]，但是，可利斯汀也有缺點，在高劑量使用下會誘發細菌自身表現 mcr-1 基因[3]，讓細菌外膜脂多醣的電荷性稍微有小改變，因此與可利斯汀產生排斥而具有抗藥性；此外，高劑量可利斯汀會對人體會產生腎毒性和神經毒性[2]，因此如何保衛最後一線用藥的抗生素是目前很具急迫性的議題，也就是改善可利斯汀的劑量使用和毒性問題[4]。本團隊設計一種可以清除細菌殘骸脂多醣的超分子陷阱（the supramolecular trap，亦標示 SAuM），尺寸小於 1 奈米，其核心是主要由八顆金原子形成一平面金量子點，再用烷基密集裝飾其核心，使之外層像具有高表面比黏著層。超分子陷阱可以捕捉脂多醣，幫助抗生素擺脫脂多醣的劫持，讓抗生素得以再循環持續殺菌，無須再提高抗生素劑量，即可達到最大的殺菌效能，同時也封鎖脂多醣的生物毒性，避免脂多醣引起敗血症風險（圖一）。此一新概念於今年獲得化學領先期刊 (Angewandte Chemie International Edition, 2020, 59, 1430-1434.)之肯定，並列為 very important paper，此研究將可避免抗生素濫用所引起的抗藥性危機。
而其中所提到的『封鎖脂多醣』原理，也就是脂多醣能與此特殊超分子陷阱作用的關鍵學理，已經闡述並發表於 Nano Lett. 2018, 18, 2864-2869 [5]和自然科學簡訊第三十一卷第二期，其中機轉是：利用簡單的化學官能基（甲基或乙基）來形成黏著層，修飾於一個平面的金量子點上，可以有效縮短脂多醣結構中具有生物活性中心(lipid A)長碳鏈之間的距離，降低脂多醣與免疫細胞表面類鐸受體 4 (toll-like receptor 4)的結合，如同鑰匙孔無法被鑰匙打開一般，導致引起劇烈發炎反應下游訊息無法傳遞，進而減緩後續的連鎖性發炎反應，避免敗血症發生。
起初，超分子陷阱的結構特性使之具有專一性『封鎖脂多醣』的優勢，與抗生素併用的想法自然地順理成章成為研究的後續發展，但是，這時候實驗室發生了一重要機運巧合。團隊裡的有一組實驗人員依循常規配製培養液，用來培養細胞以探討超分子陷阱和脂多醣之議題，過程中有一半實驗組細胞發生汙染了，在普通顯微鏡下即可見到桿菌游動，本來以為是操作不甚導致，因為同時有另一組實驗人員培養的其他細胞也放置在同一培養箱裡卻沒有汙染，釐清所有汙染源的可能性之後再重新操作一次實驗，不幸地，這個汙染現象又重現於第二次實驗過程，倍感挫折與困惑的實驗人員喃喃自語地說：培養液明明有添加抗生素啊！因此讓本人有一個大膽的假設，脂多醣疑似會與培養液中的低劑量抗生素發生相互作用，使抗生素失去作用。一個細胞實驗汙染，意外地牽扯出脂多醣與抗生素之間的秘密。
首先，為了證明脂多醣會讓抗生素失去作用這假設，要先確定抗生素在沒有脂多醣存在下能殺死細菌的有效濃度，試驗結果顯示，可利斯汀（colistin）原本的有效劑量是 1 ug/mL 以上（圖二(a)，黑色長條圖），當環境中脂多醣越來越多時，可利斯汀的殺菌功能逐漸消失了，意味著用抗生素殺菌後產生無數的細菌殘骸脂多醣，這些殘骸脂多醣接著會去干擾可利斯汀的殺菌作用。若是可利斯汀合併超分子陷阱使用時，不僅能恢復可利斯汀的殺菌功能，更令人振奮的是，使用超分子陷阱能將抗生素原本的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)再減少一半為 0.5 ug/mL（圖二(b)），可用肉眼觀察細菌培養液之澄清混濁來簡單判斷是否有細菌存活，在超分子陷阱單獨使用並無法殺菌（圖二(b)，最上排），因此不會衍生細菌抗藥性問題。超分子陷阱能專一性捕捉脂多醣，在抗生素殺菌後清除細菌殘骸，且能降低抗生素最後一線用藥可利斯汀的使用劑量，即獲得殺菌功能最大化。
接著，我們想知道抗生素是否直接影響脂多醣。由於脂多醣的結構是一邊親水端而另一邊疏水端，故為兩性超分子，會自發性靠攏排列組裝形成聚集體，因此透過測量脂多醣在水中的臨界微胞濃度(critical micelle concentration)，可以推測抗生素是否真的會影響脂多醣聚集，意外地，可利斯汀是所有抗生素測試當中，增高脂多醣臨界微胞濃度最多，僅次於超分子陷阱（圖三(a)），這暗示著超分子陷阱原本要保護的對象（可利斯汀）反而變成對手，會與脂多醣結合。因此，我們安排親合力競爭實驗（圖三(b)），把脂多醣固定於平板上，單獨添加可利斯汀並定量為右邊 Y軸（圖三(b)，線(1)），單獨添加超分子陷阱並檢測之看左邊 Y 軸（圖三(b)，線(2)），都是當對照組；在同時給予可利斯汀和超分子陷阱（圖三(b)，線(3)和線(4)），在平板上檢測到的幾乎都是超分子陷阱，顯示超分子陷阱對脂多醣的親和力大於可利斯汀對脂多醣的親和力，推論超分子陷阱表面帶有疏水性的黏著層使之具有極大的親和力。
最後，我們還想知道更多關於可利斯汀是否對脂多醣的結構發生影響力，從 1999 年的文獻中 NMR 結果顯示環狀結構的可利斯汀，就像”套環”圈住在脂多醣中間[6]，當時學者解釋如此能中和脂多醣毒性。然而，同時具有親、疏水性質的脂多醣聚集體型態與其疏水端的 lipid A 之烷基間排列的疏密程度有關，且 lipid A 烷基間的間距變化更是微小到 1 埃米（1 埃米等於 0.1奈米）就決定其生物毒性的強弱[7]。因此實驗室與國家同步輻射中心合作，利用 GIWAXS 測量脂多醣 lipid A 的烷基間間距（圖三(c)），經過計算結果顯示超分子陷阱明顯壓縮 lipid A 的 dspacing（圖三(d)），把圓錐筒狀鬆散的 lipid A 變成圓筒狀較緊密的 lipid A，代表脂多醣的生物毒性降低了；而可利斯汀僅會在 lipid A 附近形成立體障礙，並沒有改變脂多醣的生物毒性結構。綜合以上結果，證實是脂多醣綁架抗生素使其失去殺菌作用，而超分子陷阱能有效改變脂多醣構型，進一步降低脂多醣生物毒性。
為了解答超分子陷阱與抗生素併用的奈米醫療應用面，利用小鼠來模擬醫院住院患者常見的肺部細菌感染，給予不同劑量低、中、高劑量的可利斯汀治療，五天後的存活率都約有 40%到50%；如果低劑量可利斯汀同時混合給予等比例劑量或是兩倍劑量的超分子陷阱，肺感染小鼠的存活率依超分子陷阱劑量可以增加到 60%到90%（圖四），活體實驗再次證明超分子陷阱能降低抗生素使用劑量即能發揮最大藥效。因此，超分子陷阱能降低抗生素的有效劑量，未來將能避免抗生素藥物濫用、藥物毒性問題、及抗藥性的潛在危機。
圖四 超分子陷阱減少抗生素劑量並提升肺感染小鼠存活率
參考文獻
[1] World Health Organization, 2019. Available at https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/106
65/330420/9789240000193-eng.pdf.
[2] T. B. Tran, T. Velkov, R. L. Nation, A. Forrest, B. T. Tsuji, P. J. Bergen and J. Li, Int. J. Antimicrob. Agents 2016, 48, 592-597.
[3] Q. Yang, M. Li, O. B. Spiller, D. O. Andrey, P. Hinchliffe and H. Li, et al., Nat. Commun. 2017, 8, 2054.
[4] R. S. Hotchkiss and E. R. Sherwood, Science 2015, 347, 1201-1202.
[5] F.-H. Liao, T.-H.Wu, Y.-T. Huang, W.-J. Lin, C.-J. Su, U.-S Jen, S.-C.Kuo and S.-Y. Lin, Nano Lett. 2018, 18, 2864-2869.
[6] P. Pristovsˇek and J. Kidricˇ, J. Med. Chem. 1999, 42, 4604-4613.
[7] K. Brandenburg, H. Mayer, M. H. J. Koch, J. Weckesser, E. T. Rietschel, U. Seydel, Eur. J. Biochem. 1993, 218, 555—563.
